综述解读：m6A对病毒复制和T细胞稳态的调节作用 | m6A专题

摘要

RNA修饰在真核生物，细菌和古细菌中丰富。N6-甲基腺苷（m6A）是一种主要在信使RNA（mRNA）中发现的RNA修饰类型，对mRNA的代谢和功能具有重大影响。这种修饰受三种类型的蛋白质支配，即甲基转移酶（称为“书写者”），脱甲基酶（与“擦除者”相同）和特定的m6A结合蛋白（YTHDF1-3）作为“阅读器”。此外，它对于细胞生命的调节很重要，并且在包括病毒复制，干细胞分化和癌症发展在内的许多生物学过程中具有关键作用，并通过控制基因表达发挥其作用。在此，我们总结了m6A在病毒复制和T细胞调节方面的最新研究进展，这是一个快速发展的领域，将促进抗病毒疗法的发展和先天免疫的研究。

引言

细胞中丰富的RNA修饰被认为是基因表达必不可少的RNA标签（Engel和Chen 2018; Sanchez-Vasquez等人2018）。M6A是RNA尤其是信使RNA（mRNA）含量最高的修饰之一（Gonzales-van Horn和Sarnow 2017;伊万诺娃等。2017; Shi等。2017）。这种修饰加快了转录本的周转（Zhao et al.2017）。它还可以调节RNA的活性，包括其转录，翻译（Wang等，2015），衰变（Cao等，2016; Huang和Yin 2018）以及参与诸多生物学过程（Shi等，2017）。细胞分化，胚胎发育（Batista等人2014）和应激反应（Wu等人2017; Zhou等人2015）。

图1 m6A甲基化的机制 RNA，尤其是mRNA，被甲基转移酶METTL3，METTL14和WTAP甲基化，而甲基化酶FTO和ALKBH5则将其逆转。此外，YTHDF1-3可以识别m6A修饰的mRNA，从而导致降解或翻译。

在细胞中，m6A甲基化受到三种蛋白质的影响。它是由甲基转移酶安装，其功能为“编写者”；被称为“擦除者”的脱甲基酶逆转，并被特定的m6A结合蛋白识别充当“读者”（图1）（Yue等，2015）。甲基转移酶“书写者”包括METTL3，METTL14，还有和肿瘤相关的WTAP和METTL16，在哺乳动物细胞中METTL3和METTL14形成异二聚体复合物以调节mRNA的m6A甲基化; 甲基化主要发生在终止密码子附近的5’UTR和3’UTR中，但也可能存在于长外显子中（Gonzales-van Horn和Sarnow 2017）。

此外，METTL3和METTL14的甲基化可以通过脱甲基酶逆转，例如脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）和AlkB同系物5（ALKBH5），它们起着"清除子"的作用，属于ALKB家族（Aik等，2014年；朱和易2014）。FTO倾向于结合mRNA中的内含子区域，特别是结合剪接外显子附近的位点。然后m6A形成两个中间体，即N6-羟甲基腺苷（hm6A）和N6-甲酰腺苷（fm6A）（Fu et al.2013），缺乏FTO会导致前mRNA发生实质性变化和外显子跳跃。（Bartosovic et al.2017）。ALKBH5直接结合m6A修饰的mRNA的腺苷（Wu等人2017; Zheng等人2013）。

此外，m6A的修饰受“阅读器”调控，其中包含YTH结构域，特别是蛋白质YTHDF1-3，它们都特异性结合m6A修饰的mRNA（Wu等人2017）。一些研究表明YTHDF3与YTHDF1一起加速了mRNA的翻译（Li等，2017a），并促进了m6A RNA的降解（Shi等，2017）。但是，一些研究表明YTHDF2可能对RNA发挥双重作用。例如，发现YTHDF2通过促进产生HIV的CD4 +细胞中的mRNA翻译来增强HIV-1蛋白和RNA表达（Kennedy等人2017; Lu等人2018），但它也通过降解gRNA抑制HIV感染。HIV-1靶细胞（Lu等人2018; Tirumuru等人2016）。此外，还有其他具有YTH域的“阅读器”，称为YTHDC蛋白，包括YTHDC1-2，它也可以通过优先识别细胞核中的GG(m(6)A)C序列来识别m6A位点（Xu等人，2014）。

许多科学家将研究重点放在N6-甲基腺苷在重要过程中的作用，包括T细胞功能，病毒活性和癌症，目的是设计新的疗法。我们总结了该领域的最新成就，系统地阐述了N6-甲基腺苷在该过程中的作用。

m6A在病毒中的调控

在20世纪，发现m6A修饰在包括流感（Krug等，1976），牛痘病毒（Wei和Moss，1975），劳斯肉瘤病毒（Kane和Beemon，1985）和猿猴病毒40（SV40）的病毒中广泛存在。（Canaani et al.1979）。最近的研究表明，m6A也存在于其他病毒中，例如人免疫缺陷病毒（HIV）（Kennedy等人2017; Lichinchi等人2016a; Lu等人2018; Tirumuru等人2016），疱疹病毒（Hesser 等人，2018; Ye 2017; Ye等人2017）和黄病毒科（Gokhale等人2016; Lichinchi等人2016b）; 在多瘤病毒（Finkel和Groner 1983; Tsai等人2018）和甲型流感病毒（IAV）（Courtney等人2017）的研究中也取得了很大进展。

人类免疫缺陷病毒中的m6A修饰

最近，三个小组揭示了m6A甲基化在HIV生命周期中的重要作用（Kennedy等人2017; Lichinchi等人2016a; Tirumuru等人2016）。他们确认，m6A甲基化对病毒复制和病毒基因表达是有益的。具体来说，当他们抑制脱甲基酶FTO和ALKBH5并在它们抑制甲基转移酶METTL3和METTL14时降低（Kennedy等人2017; Lichinchi等人2016a; Tirumuru等人2016）。此外，三个团队确定了m6A站点的位置。尽管他们都将站点映射到50个UTR，env / rev和30个UTR，但这些出版物之间也存在一些差异。肯尼迪等人划分这些站点分成四个m6A集群，其中包含两个或三个潜在的m6甲基化位点，包括env / rev簇，U3 / NF-jB簇，反式激活应答（TAR）簇和Nef簇。当使用YTHDF蛋白结合m6A位点时，在主要HIV-1分离株BaL和JR-CSF的Nef簇中还有一个编辑过的位点（Kennedy et al.2017）。

相反，Lichinichi等鉴定了位于剪接点，编码区和非编码区的14个不同的m6A甲基化峰，其中包括在结构区中病毒Rev蛋白结合的Rev反应元件（RRE）中的两个（Lichinchi等人2016a） 。Tirumuru等鉴定了结合YTHDF1-3的m6A位点的多个CLIP峰，覆盖了50个UTR前导序列，env / rev和30个UTR中的TAR（Tirumuru等人2016）。此外，这些出版物中的两个表明，HIV-1感染后m6A基序的丰度发生了变化。Lichinichi等。证明在感染的T细胞中MGACK（A / C-GAC-G / U）基序的频率增加了，然后在HIV-1 RNA中首选了UGAC基序和MGACK基序（Lichinchi et al.2016a）。Tirumuru等人报道了感染的原发性CD4中RRACH基序富集略有增加，GGACU基序降低。T细胞在其中两项研究中，发现YTHDF1-3蛋白的作用非常不同。肯尼迪等表明YTHDF蛋白在CD4中过表达？T细胞增加了病毒复制以及HIV-1病毒蛋白和mRNA的表达，他们得出结论，转录后的m6A编辑和YTHDF1-3蛋白是HIV-1感染的阳性调节剂（Kennedy等人2017）。

相反，Tirumuru等发现YTHDF1-3是抑制剂，并降低了HIV-1的逆转录，以抑制CD4中的HIV-1感染，过度表达时的T细胞（Tirumuru等人2016）。Lichinichi等人的结果与Kennedy等人的研究相似，这些作者还发现m6A甲基化调节Rev蛋白与RNA中RRE的相互作用，并且m6A在RRE凸起区域修饰的A7883位点的甲基化干扰了HIV-1复制。和RNA核出口（Lichinchi等人，2016a）。

为了解释基于这些不同组的结果的YTHDF1-3的不同作用，Tirumuru等人使用不同的细胞系，尤其是HIV-1-靶细胞系和病毒加工细胞系，进行了进一步的分析。在HIV-1靶细胞系（例如HeLa细胞）中，YTHDF1-3通过降低gRNA的水平并防止病毒逆转录来抑制HIV-1感染。在病毒处理细胞系中，例如用pNL4-3或TZM-b1转染的HEK293T细胞，YTHDF1-3蛋白促进了病毒gag的表达和病毒产生，但抑制了HIV-1的感染性（图2）。此外，优先结合m6A RNA的YTHDF1-3蛋白在HIV-1 m6A-RNA存在下与gag形成复合物（Lu等人2018）。这些结果解释了YTHDF1-3在不同细胞系中的不同作用。

此外，除了不同的细胞外，多种试剂和实验方法还可以解释YTHDF蛋白在病毒复制中截然相反的作用。肯尼迪等主要集中在病毒RNA的转录，而Tirumuru等更加注意病毒RNA的逆转录。因此，m6A对细胞中病毒RNA的调控可能很复杂。尽管关于m6A在调节HIV病毒复制和病毒基因表达中的作用的研究结果不一致，但所有三篇出版物都表明m6A甲基化在HIV的生命周期中起着重要作用，这表明病毒基因的甲基化可能是 艾滋病患者的潜在治疗目标，尽管这种方法的有效性需要验证。

图2  m6A甲基化在HIV-1生命周期中的作用。当HIV-1病毒进入靶细胞时，从HIV-1基因组转录的暴露的gRNA被YTHDF1-3蛋白识别并降解，从而抑制了逆转录和病毒感染（左图）。在HIV-1处理细胞中，gRNA被甲基化并被YTHDF1-3蛋白识别，从而促进HIV-1 Gag蛋白表达和病毒产生（右）。

疱疹病毒中的m6A修饰

延迟是所有疱疹病毒的特征，在某些药物（例如12-O-十四烷酰佛波醇13-乙酸盐（TPA），肿瘤坏死因子α（TNF-a）等存在下，这些病毒可被诱导进入生产性裂解复制。），丁酸钠和过氧化氢（HeO.2017）。卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种疱疹病毒，是一种致癌性人脱氧核糖核酸（DNA）病毒。最近的三篇出版物揭示了KSHV mRNA含有m6A修饰。在被KSHV感染的细胞中，当刺激潜伏的KSHV进行裂解复制时，被m6A甲基化修饰的mRNA的水平会增加（Hesser等人2018; Ye 2017; Ye等人2017）。此外，Ye等和Hesser等发现通过敲低METTL3抑制m6A可以抑制编码复制转录激活因子（RTA）的pre-mRNA的剪接，这对于KSHV的裂解复制很重要，在敲除FTO后获得相反的结果（Hesser et al.2018; Ye等（2017）。此外，叶等通过使用m6A催化反应抑制剂3-脱氮杂腺苷或FTO选择抑制剂甲氧氯萘酸获得了类似的结果（Ye等人2017）。因此，m6A甲基化有利于裂解KSHV基因表达和复制。这两个团队还揭示了裂解开关蛋白RTA强烈诱导m6A甲基化并增强了其自身的前mRNA剪接（Hesser等人2018; Ye 2017; Ye等人2017）。他们在不同的细胞中发现，当通过TPA刺激激活KSHV时，开放阅读框50（ORF50 / RTA）的多个m6A位点负责ORF50（RTA）pre-mRNA剪接。他们还发现ORF50（RTA）前mRNA的m6A位点被YTHDC1和剪接因子SRSF3和SRSF10结合在核中（Ye 2017; Ye et al.2017），而这些位点在YTHDC1-3中被YTHDF1-3结合。细胞质（Hesser et al.2018）。Ye等证明RTA可以通过转录和转录后机制提高自身表达，KSHV具有两种相反的机制来操纵宿主m6A机制分别调节裂解复制和潜伏期（Ye 2017; Ye et al.2017）。Hesser等结果表明，m6A途径控制转录后的ORF50表达，导致ORF50启动子发生后续缺陷（Hesser等人2018）。

这两组的实验是使用不同的细胞系进行的，但他们获得了相似的结果，特别是m6A通过调节RTA pre-mRNA的剪接对KSHV基因的表达和复制具有积极作用。这些结果表明，这种转录组修饰可能在其他疱疹病毒中起相似的作用。因此，了解m6A修饰在其他疱疹病毒中的作用和调控机制可为控制疱疹病毒感染提供新的策略。

黄病毒科的m6A修饰

黄病毒科的成员，包括寨卡病毒（ZIKV），登革热病毒（DENV），西尼罗河病毒，黄热病病毒（YFV）和丙型肝炎病毒（HCV），均为阳性单链RNA病毒。最近的研究表明黄病毒科病毒均含有m6A修饰位点，这些位点可调节其基因表达和复制（Gokhale等，2016；Lichinchi等，2016b）。

Gokhale等报告说明，m6A在调节HCV的生命周期中起着重要作用。剔除METTL3和METTL14可增加感染性HCV颗粒的产生，YTHDF1-3蛋白识别并结合HCV RNA的m6A位点以抑制病毒感染，表明m6A对HCV负调节。然后，该小组对HCV RNA基因组的m6A位点进行了定位，发现m6A通过增加RNA与HCV核心蛋白之间的相互作用来增强病毒效价。最后，他们描述了其他几种黄病毒科病毒RNA m6A转录组图，包括ZIKV，DENV和YFV。综上所述，他们的发现揭示了m6A调节病毒感染，并构成了未来研究的基础，以探索m6A在更广泛的黄病毒科病毒家族中的功能（Gokhale et al。2016）。

ZIKV于1947年被发现（Driggers等，2016），它可以诱发严重的神经系统缺陷。Lichinchi等。报道ZIKV感染改变了N6-甲基腺苷的拓扑结构以及病毒和人类RNA的功能。他们通过进行甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）实验鉴定了12个m6A峰，这些峰在ZIKV RNA中丰富。击倒METTL3 / METTL14或ALKBH5 / FTO分别增加或减少病毒mRNA水平。此外，发现沉默的YTHDF1-3蛋白可结合ZIKV病毒RNA，从而抑制复制。作者还发现ZIKV感染会影响宿主细胞转录本的RNA甲基化位点，并且新的m6A位点优先沉积在50UTR和编码序列中（Lichinchi等人，2016b）。

如上所述，这些研究表明，m6A甲基化在调节黄病毒中起重要作用。甲基转移酶METTL3和METTL14可以修饰ZIKV和HCV中的mRNA并抑制病毒复制。但是，酶FTO和ALKBH5可以抑制这种作用，因此对这些病毒的生命周期产生不利影响。此外，YTHDF1-3识别m6A修饰的位点以降解病毒mRNA。这些研究表明宿主中的甲基化调节蛋白对黄病毒科病毒具有抑制作用，这为相关感染的临床治疗提供了新的方向。

多瘤病毒中的m6A修饰

早在1970年代，就在SV40中发现了m6A甲基化，该基因属于多瘤病毒，这是一种小型DNA肿瘤病毒家族（Canaani等，1979; Finkel和Groner 1983; Tsai等，2018）。发现在SV40的mRNA中m6A甲基化的位点出现在两个序列中，特别是在编码病毒结构蛋白的转录本中的Gpm6ApC和（Ap）nm6ApC（Canaani等人，1979）。在1980年代，Finkel等人。证实前mRNA中的m6A甲基化对于SV40晚期mRNA的形成很重要（Finkel和Groner 1983）。最近，蔡等人。发现在原型SV40晚期mRNA中添加m6A在增加病毒基因表达和复制中起着重要作用（Tsai等人2018）。蔡等在晚期转录本中定位并鉴定了11个m6A位点，并发现m6A结合蛋白YTHDF2的过表达导致更快速的病毒复制和更大的病毒斑块，表明m6A在SV40基因表达中发挥了积极作用。有趣的是，未发现SV40的可变剪接受m6A调控。这些结果表明在SV40晚期mRNA中添加m6A可以增强病毒结构基因的表达和复制（Tsai等人2018）。

甲型流感病毒中的m6A修饰

IAV在1976年首次发现具有m6A修饰的mRNA，每种流感病毒mRNA种类平均包含三个m6A残基（Krug等人，1976）。Narayan等确定在不同的流感病毒mRNA中m6A修饰的分布是不同的（Narayan等，1987）。最近，Courtney等人综述了有关IAV基因表达和复制的m6A修饰的调控机制。他们证明，人肺上皮细胞系A549中METTL3的突变失活抑制了IAV复制，YTHDF2的过表达增加了IAV复制和感染性颗粒的产生，这表明m6A甲基化对于IAV的生命周期是有利的。但是，并非包括RNA / cRNA（正）链和vRNA（负）链在内的所有RNA都表现出升高的m6A水平。鉴定出在编码结构蛋白HA，NA，M1 / M2和NP的病毒mRNA中，m6A甲基化水平较高，而在编码病毒聚合酶蛋白PB2，PB1和PA的mRNA中水平较低。同时，在突变的IAV中观察到较低水平的HA mRNA和蛋白，而其他IAV mRNA和蛋白未发生变化（Courtney等人2017）。这些结果表明，m6A甲基化调节IAV基因复制和某些蛋白质的表达。

乙型肝炎病毒中的m6A修饰
最近，已经报道了对乙型肝炎病毒（HBV）RNA的m6A修饰。此外，证实了m6A修饰在HBV生命周期中的双重作用，因为这被发现导致HBV相关蛋白表达降低，但增强了HBV pgRNA的逆转录过程（Imam等人2018）。
m6A修饰的宿主因素

同时，一些研究报道了m6A甲基化在病毒-宿主相互作用中的功能。Kariko等发现未修饰的RNA可以通过激活Toll样受体（TLR）来刺激先天免疫系统，但是修饰的RNA（包括受m6A甲基化影响的RNA）不能激活TLR并触发免疫防御系统（Kariko等，2005）。同样，视黄酸诱导型基因I（RIG-I）可以识别RNA以激活先天免疫信号，但不会被m6A修饰的病毒RNA触发，介导先天免疫系统的病毒逃逸（Durbin et al.2016）。此外，DEAD-box（DDX）46是DDX解旋酶家族的成员，与抗病毒基因Mavs，Traf3和Traf6编码的RNA结合在细胞核中，并募集m6A脱甲基酶ALKBH5对这些RNA进行脱甲基化并将其保留在核，从而抑制病毒感染期间体内的抗病毒先天免疫力（Zheng et al.2017）。这些结果表明，m6A修饰不仅调节病毒的生命周期，而且还对宿主的先天抗病毒免疫力产生影响。这为研究m6A修饰对抗病毒免疫的作用提供了更广阔的研究方向。

总而言之，m6A修饰对于病毒的生命周期很重要，并且随着m6A修饰在不同病毒中的研究越来越广泛，m6A修饰可以提供对抗病毒感染的新治疗策略。

T细胞中m6A的调节

mRNA上的N6-甲基腺苷会影响基因表达的大多数转录后步骤，并与RNA代谢相关，包括RNA稳定性，剪接，转运，翻译和定位（Brocard et al.2017）。m6A通过募集hnRNPC（一种参与premRNA加工的核RNA结合蛋白）来调节选择性剪接（Liu等人，2015）。“阅读器”可以通过减少Hu抗原R的结合来提高mRNA的稳定性（Brocard等，2017）。尽管m6A甲基化在不同细胞类型中对mRNA的影响相似，但在多种细胞中仍具有不同的功能。

Li等人证明T细胞稳态是通过靶向白介素7 /信号转导子和转录激活因子5 /细胞因子信号转导抑制子（IL-7 / STAT5 / SOCS）的途径受m6A mRNA甲基化控制的，从而调节稳态，分化和增殖。初始T细胞STAT信号可以被SOCS家族的成员SOCS1，SOCS3和CISH抑制，其mRNA受到m6A的靶向。在野生型初始T细胞中，YTHDF1-3识别Socs1，Socs3和Cish m6A mRNA，并迅速降解，IL-7信号激活了Janus激酶（JAK）/ STAT通路，以调节体内稳态，分化，初始T细胞的增殖和增殖（图3）。在缺少METTL3的天然T细胞中，以m6A标记的Socs1，Socs3和Cish mRNA表现出较慢的衰变，从而导致这些mRNA的水平更高和蛋白质表达增加。发现SOCS家族的活性增加抑制IL-7 / STAT信号传导途径并抑制T细胞稳态，分化和增殖。此外，作者发现，在缺少METTL3的初始T细胞群体中，TH1和TH17细胞减少了，而TH2细胞却增加了，但是与野生型初始T细胞相比，Treg细胞的比例没有变化。然而，m6A修饰在T细胞凋亡或TCR介导的增殖中不起作用（Li等人2017b）。

图3初始T细胞中m6A甲基化的调节。SOCS家族抑制IL-7 / STAT5 / SOCS通路，从而负调节初始T细胞的稳态，分化和增殖。但是，SOCS家族的RNA可以在细胞核中被甲基化，在那里它们被YTHDF3识别并在细胞质中降解，以维持初始的T细胞稳态，分化和增殖。

同时，Tong等人揭示m6A mRNA甲基化具有Treg抑制功能。通过绘制m6A修饰的图谱，他们发现它们在Treg细胞的30UTR和50UTR中以共有序列发生。发现METTL3的耗尽会增加SOCS的mRNA水平并抑制IL-2 / STAT5信号传导，这对于Treg的功能和稳定性是必不可少的（Tong等人，2018）。这些结果表明，在不同的T细胞亚型中，m6A RNA修饰的目标基因除了抑制Tregs的功能外，还编码调控初始T细胞分化的信号传导途径的基本组成部分。

此外，一些研究发现T细胞与宿主的抗病毒机制有关，这对于HIV尤其如此（Che等人2010; Smith等人2016）。暴露有HIV-1的树突状细胞培养的初始T细胞的初次扩增减少，因此，在HIV-1感染的个体中体内免疫功能异常得以发生（Che等人，2010年）。此外，发现在持续的HIV-1抗逆转录病毒治疗期间需要初始的CD8 + T细胞（Smith等人，2016）。此外，TH1细胞可以分泌白介素21和干扰素-c，这是在IAV感染期间维持IgG2的抗病毒作用所必需的（Miyauchi等，2016）。因此，m6A甲基化可能通过调节初始T细胞的稳态，分化和增殖来间接调节宿主的抗病毒作用，这也可能提供抗病毒治疗的新策略，特别是通过调节初始T细胞。

结论与观点

N6-甲基腺苷在病毒复制和T细胞稳态中起着至关重要的作用。在病毒感染期间，m6A修饰的mRNA水平显着升高，因此促进了病毒基因的复制和表达。但是，YTHDF2的功能因病毒而异，由于使用的细胞系和实验方法不同，不同团队获得的某些结果也存在冲突。此外，T细胞稳态由靶向IL-7 / STAT5 / SOCS途径的m6A mRNA甲基化控制。

 这种m6A甲基化修饰存在于病毒中，并调节其生命周期。但是，仍有一些问题需要解决。对于表现出潜伏期的病毒，m6A甲基化是否在潜伏期或激活中起作用，以及病毒在感染期间如何劫持m6A机制仍是未知的。此外，对于许多病毒，m6A甲基化的作用仍然未知。随着技术的进步和实验方法的不断改进，这些问题将来可能会得到解决。

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